Глава 5
РЕАЛЬНАЯ СТРУКТУРА ЖИВОЙ КЛЕТКИ; ПОСЛЕДСТВИЯ НЫНЕШНИХ СООБРАЖЕНИЙ

Непримиримо применив Бритву Оккама, теперь можно снова взглянуть на живую клетку. Наш вывод состоит в том, что его структура очень похожа на общепринятую в начале 1940-х годов (рис. 3). Существует окружающая-мембрана, по-видимому, толщиной в один слой. Вероятно, он содержит белки и липиды, которые могут быть ориентированы слоями (Danielli and Davson, 1936; Finean, 1959) или могут быть более случайными (Bennett, 1969; Toner and Carr, 1971, стр. 6; Van Brug- gen, 1971). Несмотря на много споров, трудно однозначно интерпретировать эксперименты, подтверждающие ту или иную модель. Внеклеточное пространство очень мало. Формы ядер и ядрышек в живых клетках постоянно, но часто незначительно, меняются.
Цитоплазма представляет собой довольно прозрачную суспензию с низким показателем преломления, содержащую митохондрии, гранулы, капли и иногда вакуоли, находящиеся в постоянном движении. В клетках относительно мало цитоплазматических включений, которые не секретируют, не действуют как фагоциты и не питаются частицами материала. Отсутствует эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи. Митохондрии представляют собой удлиненные трубки; они имеют тонкую однослойную однородную мембрану и, вероятно¬, содержат однородную жидкость - "митохондриоплазму"; кристы отсутствуют. Гранулы и капли в цитоплазме могут состоять или содержать кристаллы, ферменты, проглоченные частицы, нерастворимые макромолекулы или бактерии. В растительных клетках, простейших, клетках тканевой культуры и клетках¬ретикулоэндотелиальной системы; частицы могут встречаться в вакуолях.
Ядерная мембрана имеет толщину в один слой и неперфорирована. Нуклеоплазма выглядит довольно однородной и окружает ядрышко. Ядрышко в нейронах окружено мембраной, но неизвестно, присутствует ли такая мембрана в других нормальных клетках. Ядрышко также находится в¬непрерывном медленном движении, а также его части медленно растворяются и осаждаются. Кажущееся прозрачным пространство между нитями ядрышка называется "pars amorpha".
Предлагаемая в настоящее время структура отличается от структуры, наблюдаемой Альтманом (1890), наличием ядрышка и, возможно, ядрышковой мембраны (рис. 18).
Появление артефактов
Должны быть проведены обширные исследования внешнего вида и артефактов, обнаруженных при фотонной и электронной микроскопии, с использованием как можно большего числа полностью независимых методов, использующих различные физические принципы.
Как каждый шаг может привести к появлению артефактов
Любые новые методы должны быть проанализированы, чтобы увидеть, каким образом каждый шаг может привести к появлению артефактов. Целью такого анализа должна быть как количественная, так и качественная оценка влияния каждой манипуляции с животным, каждого этапа экспериментальной процедуры и каждого химического реагента на конечный внешний вид ткани. Эмпирическая гистология, возникшая в девятнадцатом веке, все еще служит важной патологической цели, но не обязательно информирует нас о состоянии клеток внутри живого животного (Baker, 1958; Hillman and Deutsch, 1978).
Иерархия доказательств
Если предложенная нами иерархия доказательств (Приложение 2) неприемлема, каждый научный сотрудник должен разработать личную иерархию, чтобы анализировать свои собственные эксперименты, а также опубликованные статьи. Это создало бы логическую основу для объективной оценки экспериментальных данных. При разработке¬новых графиков экспериментов предпочтение следует отдавать экспериментам, дающим доказательства ближе к вершине иерархии, чем экспериментам, находящимся ниже (Hillman, 1976).
Вертикальный подход к биологии
В экспериментах в области биологии, биохимии и особенно в фармакологии мы бы рекомендовали следующий подход, который мы называем "вертикальным подходом к изучению механизмов". Можно построить пирамиду, состоящую из следующих блоков, идущих от основания вверх:
фиксированная ткань
диализированная ткань (Хиллман, Столлери и Джоанни, 1974; Хиллман, 1975)
гомогенат сырой ткани
кусочки ткани
культуры тканей
изолированные функциональные органы
те же органы in vivo
все животное целиком
Например, если кто-то изучает механизм ионного насоса натрия, мы должны сначала посмотреть, как ион натрия связывается с диализируемой тканью, из которой были удалены все мелкие растворенные вещества. Затем в экспериментальных смесях одну за другой заменяют идентифицированные небольшие молекулы и смотрят, влияет ли каждая из них и как она влияет на ассоциацию иона натрия с тканью. Затем смесь нагревают до температуры тела, добавляют субстраты и сопутствующие факторы и наблюдают влияние каждого из них на рассматриваемую реакцию. Следующим шагом является тестирование гомогената сырой ткани.
Любой механизм, обнаруженный в остатках диализа или неочищенном гомогенате, должен быть свойством стабильных, нерастворимых химических материалов, из которых состоит ткань. Затем приступают к исследованию его в срезах ткани.¬Можно заключить, что дополнительные свойства срезов ткани, отсутствующих в гомогенате, связаны с целостностью по меньшей мере части ткани. Культура ткани, которая растет, обладает свойствами, очевидно, более близкими к состоянию in vivo, чем те, которыми обладают¬выжившие срезы ткани. Его активность можно непосредственно наблюдать с помощью оптической микроскопии во время экспериментов. Оптимальный изолированный орган имеет-артериовенозную разницу, аналогичную той, которая обнаруживается in vivo, и может синтезировать аналогичные¬продукты; например, изолированное вымя вырабатывает молоко, изолированное сердце-сокращается и работает. Конечно, изолированные органы не имеют нормальных нервных или гормональных влияний, поэтому разница между результатами, полученными от них, и результатами in vivo будет указывать на то, как на эти функции влияют последние¬влияния. Хотя было бы несправедливо ожидать, что какой-либо аспирант сам взберется на всю эту пирамиду, директора институтов или исследовательских групп могли бы систематически изучать структуры, механизмы и действие лекарств таким образом. Очевидно, что их задачей было бы обеспечить, чтобы любые очевидные аномалии, обнаруженные между различными уровнями иерархии, были тщательно проанализированы и устранены. Кроме того, в то время как биохимический или лекарственный механизм не мог быть проще в системе выше в пирамиде, которая была бы найдена ниже, ее эффект должен был бы быть "вычтен" из результатов, полученных в более сложных системах, чтобы определить нервные и гормональные влияния in vivo. Парадокс заключается в том, что обычно изучают "функцию" живых животных или тканей на одном конце иерархии и пытаются соотнести это со структурой, которая находится на другом. По аналогии с размерным анализом в физике и химии, различные препараты можно рассматривать как различающиеся по размерам. Этот парадокс делает связь "структуры" с "функцией" особенно сложной.
Неприемлемость несовместимых доказательств
Следует отказаться от нынешней ограниченности признания того, что взаимоисключающие результаты в клеточной биологии и электронной микроскопии, например, полученные с использованием¬различных методов, могут сосуществовать или игнорироваться. Неопределенные пренебрежительные или неточные замечания о методах, используемых другими работниками, или отказ рассматривать их результаты не должны быть приемлемы как часть нормального научного общения. Нельзя¬также допускать несовместимости результатов, полученных на разных уровнях экспериментальной иерархии.
Световая микроскопия и живые клетки
С помощью электронной микроскопии был сделан ряд важных выводов о структуре клеток. Два из них - исследование мышц, которое привело к гипотезе скользящих нитей мышечного сокращения (Хаксли, 1957; 1972; Мур, Хаксли и де Розье, 1970), а также элегантные снимки¬поверхности диатомовых водорослей (Хенди, 1959; Мосс и Гиббс, 1974). В первом исследовании соблюдалась геометрия, поскольку форма нитей была продемонстрирована в трех измерениях; во втором исследовании диатомовые водоросли состоят из чрезвычайно¬стабильного кремнезема, и электронно-микроскописты изучали его поверхность. Тем не менее, до тех пор, пока не будет доказано, что электронный микроскоп¬дает информацию о живых клетках, мы бы решительно выступали за возрождение интереса к световой микроскопии.
Следствием этого является то, что в школах и колледжах должно быть больше преподавания световой микроскопии. На наш взгляд, нет лучшего способа¬изучить биологическую функцию по отношению к структуре, чем терпеливо и с любопытством сидеть в течение нескольких часов подряд, наблюдая за безмятежным поведением живых организмов.
Соотношение структуры и функции
Структура и функции должны быть исследованы в одном и том же препарате, когда это возможно. Если это невозможно, следует свести к минимуму количество вмешательств с тканью между применением двух различных методик.
Предлагаемые новые методы
При изучении живых систем можно сосредоточиться на использовании неразрушающих¬, неинвазивных методов; можно также использовать методы, вызывающие минимальное беспокойство, такие как желудочные мешки, окна мозга; внутренние канюли и ушные раковины; последняя группа иногда требует операции на животных, которым разрешено восстанавливаться полностью перед дальнейшим обследованием. Мы хотели бы предложить две новые серии техник, которые мы еще не пробовали сами, но которые мы можем предложить в качестве двух примеров простых подходов. Одним из них является разработка хроматографических методов на живых животных, которые не требовали бы мощных и нефизических экстрагентов. Мельчайшие колонки можно было бы поместить в брыжейку, субдуральное пространство или в кровеносные сосуды, и они показывали бы хроматографическую и, следовательно, химическую активность веществ in vivo и в физиологической химической среде.
Вторая система состоит из повторного изучения гистологических методов и биохимических результатов с использованием только систем реагентов, которые, как ожидается, не¬приведут к необратимым изменениям ткани. Сильные реагенты денатурируют белки (Joly, 1965), и поэтому их использования следует по возможности избегать. Следует отдавать предпочтение таким "физиологическим" реагентам, как изотонический NaCI, раствор Кребса-Рингера, сыворотка, спинномозговая жидкость и т.д. В идеале это должны быть такие реагенты, которые биолог-исследователь был бы готов ввести в свой собственный контакт¬, полагая, что они не причинят ему ни вреда, ни дискомфорта. Если это кажется немного опасным, можно протестировать реагенты на культурах тканей млекопитающих. Они балансируют на острие ножа между культивированием и разложением, и любое слегка небиологическое добавление подталкивает их к разложению. Возможно, дело здесь не требует труда; мы хотим изучить биологию живых тканей в средах, которые не изменяют их биохимически. Это едва ли более радикально, чем инкубирование тканей в растворах, в которых они могут метаболизироваться и расти, и изучение их физиологических свойств.
Можно возразить, что новые методы, предложенные выше, могут быть полезны для понимания биохимии ткани, но не обязательно ее тонкой структуры. Конечно, конформация молекул на биохимическом и физическом уровне определяет микроскопический и макроскопический вид ткани. Сокращение мышц, обработка шерсти, криоконсервация и созревание фруктов - все это примеры методов, в которых изменения химического состава отражаются на различных макроскопических проявлениях. Мы полагаем, что многие биологи предположили, что можно вызвать серьезные биохимические изменения с помощью мощных реагентов, но оставить общий внешний вид или тонкую структуру в прежнем состоянии. Может показаться банальным настаивать на том, что в клетках должна существовать тесная и точная взаимосвязь между молекулярной ориентацией и их гистологической архитектурой, но нам кажется, что это удовлетворительная интерпретация взаимосвязи структуры и функции.
Имеет ли значение субклеточная локализация?
Вполне можно утверждать, что желание локализовать биохимическую активность в субклеточных органеллах само по себе является похвальной целью, поскольку это может помочь¬соотнести форму органеллы с ее биохимической активностью. Тем не менее, хотя физиологические действия хрусталика, желудка и большинства других органов,¬по-видимому, четко связаны с их формой, по-видимому, нет причин, по¬которым активность фермента должна быть связана с конкретной формой клетки или одной из органелл. Предположим, что никто не был убежден в том, что с помощью современных методов можно выяснить, действительно ли окислительное¬фосфорилирование происходит в митохондриях in vivo; предположим, что во всей живой клетке это происходит в цитоплазме. Это не изменило бы наш взгляд на клеточную биохимию, поскольку все реагенты, которые, как полагают, участвуют в окислительном фосфорилировании, могут быть сохранены¬в цитоплазме. Поскольку митохондрии отделяют от других клеточных компонентов для исследования путем гомогенизации и центрифугирования - как при-значительном давлении, - что может повлиять на их проницаемость, мало что можно сказать об их проницаемости in vivo. Самое простое предположение состояло бы в том, что митохондрии in vivo действительно содержат большие молекулы, которые, возможно, не способны проникать через их мембраны. Однако, поскольку бактерии, по-видимому, не имеют ядер или митохондрий, но могут осуществлять большинство метаболических активностей, ясно, что разделение, обнаруживаемое с помощью световой или электронной микроскопии - в-отличие от такого явления на молекулярном уровне, - не является необходимым, поскольку все их многообразие совершенно разных биохимических активностей должно располагаться в одних и тех же отдельных отсеках у этих микробов. В многоклеточных организмах все согласятся с тем, что существует несколько тысяч ферментативных активностей, но никто не утверждает больше, чем о восьми электронно-микроскопически видимых компартментах, по сравнению с нашими пятью - ядрышком, ядром, цитоплазмой, митохондриями и внеклеточным пространством; каждый из них можно увидеть в нефиксированных¬тканях гистологически и гистохимически. Предоставление нескольких дополнительных компартментов, таких как цистерны в ретикулуме или лизосомы, не вносит большого вклада в решение проблемы размещения переполненных ферментов, субстратов или реакций. Таким образом, разделение не может быть использовано¬в качестве аргумента, требующего существования двухслойных мембран, эндоплазматического ретикулума, лизосом, пероксисом, аппаратов с ядерными порами и т.д.
Гомогенизация и разделение на части
Возможно, было бы полезно добавить замечание о философии гомогенизации применительно к биохимической цитологии. Если взглянуть на этот вопрос беспристрастно¬, то попытка обнаружить локализацию деятельности в пределах того, что предполагается отдельными отсеками, путем преднамеренного разрушения стен между ними и¬сжатия содержимого всех отсеков, а затем попытки выяснить после-подопечные, каково было предыдущее распределение веществ внутри них. Расстояния внутри клеток настолько малы, и должна происходить диффузия, так что нет необходимости приводить дополнительные механизмы, ограничивающие мембраны или¬внутриклеточные транспортные системы, чтобы объяснить, как продукты химической реакции в одной части бактериальной клетки могут перемещаться в другую. Тем более, если такие маленькие организмы в нижней части эволюционного древа могут творить такую магию, почему более крупные или многоклеточные не могут делать то же самое? Мы рискуем променять словесную уверенность на интеллектуальную неуверенность. Первое делает наши учебники более аккуратными, а преподавание - более легким, но не стимулирует нас к более тщательным или точным экспериментам, порожденным интеллектуальной неуверенностью.
Изменения в распределении органелл происходят; во-первых, во время гомогенизации; во-вторых, после добавления гомогената к градиентам в центрифужной пробирке; в-третьих, во время центрифугирования; и, в-четвертых, путем диффузии по всему препарату. К сожалению, никакие околичности,¬придумывание новых терминов или отказ научных работников признать эти простые и¬неоспоримые технические факты не могут предотвратить распространение и, таким образом, бросить вызов второму закону термодинамики. Способы, с помощью которых можно было бы предотвратить перемещение ферментов, заключались бы либо в исследовании органелл in vivo, либо в их разделении до того, как они смогут смешаться, с помощью таких методов, как следующие:
(a) спектрофотометрия расщепленным пучком препаратов метаболизирующей ткани;
(b) выделение частей клеток путем ручного вскрытия;
(c) наблюдение за живыми клетками, препарированными вручную, с помощью оптической микроскопии;
(d) трансплантация ядер;
(e) разрушительное излучение, сфокусированное на определенных органеллах;
(f) внутрицитоплазматические и внутриядерные инъекции;
(g) прямое извлечение цитоплазмы, нуклеоплазмы или аксоплазмы с помощью микропипеток;
(h) сравнение свойств клеток, лишенных определенной органеллы, такой как митохондрии, с клетками животных сходных видов, обладающими ими;
(i) использование радиоактивных прекурсоров при авторадиографии;
(j) внутрицитоплазматическая и внутриядерная регистрация активности ионов; (k) использование естественных "больших" клеток, таких как яйцеклетки, медуллярные нейроны, клетки Маутнера, аксоны кальмаров, миксикола, яйца арбаций и т.д.
Несколько примеров иллюстрируют богатство уже используемых методов такого рода, которые, как можно ожидать, приведут к минимальному перераспределению внутриклеточных органелл или их содержимого.
Преподавание семантики
Преподавание семантики обычно не является частью научных курсов. Так много понятий, таких как роль, структура, функция, механизм, транспорт, память¬, не имеют согласованного универсального значения, и поэтому при их использовании следует давать им определение.
Ситуация более серьезна, когда нечеткое определение затемняет реальное в¬соответствии с концепцией (Приложение 1 и Хиллман, 1972, стр. 115-120). Полезно пытаться определить такие расплывчатые квазифилософские термины всякий раз, когда с ними сталкиваешься. Эти выражения не совсем бессмысленны, но они имеют значение только в отношении точных измерений, для корреляции которых они используются. В целом, мы бы настоятельно призвали уделять гораздо больше внимания измерениям, проведенным экспериментатором, чем расплывчатым общим терминам, используемым интерпретаторами для придания им связности.
Целесообразность преподавания логики
Логика раньше была важным вводным предметом для многих отраслей естественных и физических наук, но она была в значительной степени исключена из учебных программ, по крайней мере в Великобритании. Нас постоянно беспокоит¬неспособность многих профессиональных работников различать выводы,¬предположения, предположения и т. Д. Важность логики нельзя преувеличивать, потому что фундаментальная ценность эксперимента в продвижении знаний зависит от степени достоверности каждого основного предположения, подразумеваемого при его использовании, особенно самого слабого предположения. Результаты любого эксперимента, которые содержат хотя бы одно важное необоснованное, нелогичное или опровергнутое предположение, следует игнорировать, если оно играет решающую роль в заключении.
Новый вид обсуждения
Чтобы улучшить качество экспериментов, следует создать новую дискуссионную группу со следующими правилами. Все участники должны говорить так, чтобы это было понятно любому другому ученому-физику, химику или биологу. Оратор должен быть готов ответить и всесторонне обсудить любой вопрос, каким бы простым или наивным он ни казался. Обсуждение должно быть полностью демократическим. Темы должны обсуждаться на пределе знаний или мнений. Проблемы, возникающие из-за недостатка знаний или расхождений во мнениях, должны быть расследованы членами и доведены до¬сведения последующего собрания. Следует обсудить такие темы, которые мало освещаются в книгах по биологии, например, теорию и допущения измерений, экспериментальные доказательства устоявшихся концепций и эксперименты отдельных исследователей.
Текущее представление
Мы бы попросили цитологов посмотреть в свои электронные микроскопы или изучить четкие микрофотографии любых клеток, в которых значительная часть поля состоит из двухслойных мембран, эндоплазматического ретикулума и ядерных пор. Избегая любого искушения руководствоваться чем-либо иным, кроме своих собственных чувств и рассуждений, они должны заново задать себе простой¬вопрос - могут ли эти изображения действительно быть изображениями действительно трехмерных¬объектов?

ПОСТСКРИПТУМ
Разумно спросить, почему цитология оказалась столь непродуктивной для получения новых и значительных результатов, учитывая очень большое число исследователей,¬занимающихся ею во всем мире. Дело не в том, что общий объем производства был небольшим, а скорее в том, что общая производительность была низкой. Это не академический вопрос, учитывая огромные ресурсы, которыми общество снабжает научных работников, и вероятное сокращение этих ресурсов в будущем.
Мы считаем, что причина низкой производительности заключалась в том, что биологам не хватало химического и аналитического подхода к своим экспериментам. Они погрузились в сложные и трудные эксперименты, в которых современное оборудование скрыло сложность, часто потому, что они не могут видеть свои приготовления к длительным периодам эксперимента. Они были удовлетворены фотографиями, следами, распечатками и другой суррогатной и отчужденной-информацией, которая психологически путается с самой живой тканью. В случае электронной микроскопии научный сотрудник может поручить специалисту-специалисту внедрить, разрезать, окрасить и сфотографировать препарат, а затем передать ему фотографии. Ему не удалось установить прямой контакт с источником своей информации, в отличие от историка-естествоиспытателя, который наблюдает за своим образцом во время его выступления. Мы утверждаем, что автоматическая природа оборудования, добавленная к сложности проводимых экспериментов, привела к тому, что исследовательские работники игнорировали эффекты своих подготовительных методов, а также предположения, которые обязательно, но часто неосознанно подразумеваются при их использовании. Его неспособность видеть ткань непосредственно позволила исследователю игнорировать грубые изменения ее состояния in vivo из-за физических¬манипуляций и химических реагентов, которым она подвергается. Интересно поразмышлять о том, как многие важные открытия цитологии были результатом прямых наблюдений, где слова используются в их буквальном смысле.
Существует недостаточный интерес к влиянию подготовки на предполагаемые результаты эксперимента, и часто попытки разжечь его встречают решительное сопротивление. Один рецензент журнала Biochemical Journal написал, что предположение о том, что физический метод может оказывать биохимическое воздействие, было революционным. Тем не менее, экспериментальное открытие никогда не может выразить большей истины, чем экспериментальная методика, используемая для его получения, соответствующий тест, используемый для его контроля, или обоснованность предположений, подразумеваемых при его использовании.
Предлагаемый здесь подход не является нигилистическим. Он предназначен для улучшения общего стандарта, поощряя людей проводить более простые и фундаментальные эксперименты. Нужно быть очень терпеливым. Мы бы предположили, что наиболее предпочтительным был бы либо "вертикальный подход" к эксперименту, либо выполнение эмпирических прикладных¬экспериментов. Эффективность последних проверяется их полезностью в применении. Эмпирические сложные эксперименты, к категории которых следует отнести большинство проводимых сегодня, являются наиболее опасными. Затем мы обращаемся с призывом к простоте предположений, техники и эксперимента.
В соответствии с вышеизложенным подходом мы хотели бы подчеркнуть важность интеллектуальной честности. Нам кажется, что самый большой приоритет должен быть отдан обучению научных работников проявлять свои критические способности,¬независимо от популярности их взглядов или "дипломатического" ущерба, который может им нанести. Интеллектуальная дипломатия должна быть ересью в научных кругах и публикациях. Ни один предмет не может быть продвинут тем, кто не готов совершить интеллектуальный скачок за пределы принятых в настоящее¬время убеждений. Это не означает, что неверие само по себе является добродетелью, но вопрос¬, несомненно, таковым является. Опрос следует продолжать до тех пор, пока либо не будет найден рационально удовлетворяющий ответ, либо не будет продуман способ определения вопроса таким образом, чтобы его можно было исследовать экспериментально. Мы хотели бы повторить, что ни один профессиональный ученый не должен позволять сосуществовать в своей дисциплине или в своем духе несовместимым взглядам в области, которая является центральной для его интересов. Это может повлечь за собой отказ от общепринятых текущих убеждений или может потребовать откровенных и громких заявлений, чтобы побудить других работников попытаться устранить расхождения. При любых обстоятельствах у всех нас есть долг перед обществом, которое верит в нашу честность и обычно платит за нашу работу.
Те из нас, кто занимается исследовательской работой, которая имеет какое-либо отношение к лечению пациентов - даже в очень долгосрочной перспективе, - должны часто напоминать себе об извилистых очередях перед нашими кабинетами для консультаций, которые очень¬терпеливо ждут результатов наших усилий.
★ * * * *
Если принять, что эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, кристы митохондрий и ядерные поры не существуют в живых клетках, то можно прийти к выводу, что все исследователи, изучающие эти артефакты в состоянии здоровья или болезни - у здоровых людей, пациентов, животных или растений - были бы с большей пользой заниматься исследованиями в других областях, на которые следует направить их нынешние огромные ресурсы.
Мы прогнозируем, что наши взгляды будут широко приняты к тому времени, когда повзрослеют еще два поколения научных работников.